Technologie LUCS
L’approche AOP repose sur une technologie unique, capable de mesurer l’effet des antioxydants sur des modèles de cellules vivantes. Cette technologie a pour origine un test de fluorescence dont les mécanismes intimes ont été décrits au niveau intracellulaire ces dernières années (2015-2017). Cette découverte majeure a fait l’objet d’un article important signé par l’équipe AOP et publié par le magazine international Nature (version online, Scientific Reports) le 22 décembre 2017 (réf : https://www.nature.com/articles/s41598-017-18211-2.pdf). Ce test, nommé LUCS (pour Light Up Cell System), utilise les variations d’intensité de fluorescence du thiazole orange (TO), un biocapteur nucléaire de la famille des cyanines asymétriques, pour établir l’état d’homéostasie de la cellule.
Cette propriété unique a permis de mettre au point un test de mesure traduisant les effets antioxydants cellulaires. Le test a été standardisé sur plaques de culture 96 puits. Il est disponible sur tout modèle cellulaire (contenant de l’ADN) et pour tout type d’échantillons de source industrielle (substances pures, extraits, produits finis,…)
Il découle de ces découvertes que la production de stress oxydatif peut, pour la première fois, être contrôlée dans la cellule en appliquant simplement la puissance lumineuse utile à la photo-activation du biomarqueur.
Principe du tests LUCS
Le protocole utilisé est simple. Le biocapteur (thiazole orange, TO), ajouté dans le milieu de culture cellulaire, s’associe aux acides nucléiques présents dans la cellule et devient fluorescent. A la suite d’un mécanisme de photo-activation déclenché par une illumination à 480 nm, le biocapteur se relaxe en transférant une partie de son énergie à l’oxygène intracellulaire déclenchant via la production d’oxygène singulet une cascade de production d’espèces oxygénées réactives (EOR ou ROS) dont l’anion superoxyde (O2.–) et le radical hydroxyl (OH.) (figure 1). L’effet antioxydant est mesuré par la capacité de l’échantillon testé à neutraliser cette production de ROS intracellulaire.
Profils dose-effet
L’effet antioxydant intracellulaire se traduit par un retard dans le temps de l’augmentation de fluorescence induite par la photo-activation du biocapteur sous l’effet de flashs lumineux successifs. La figure 2 illustre le profil de fluorescence de cellules HepG2 humaines non traitées (courbe noire) et les profils obtenus après 4 h de traitement avec différentes concentrations en resvératrol, un puissant antioxydant cellulaire connu pour agir à la fois comme piégeur de ROS et stimulateur de la voie de défense antioxydante naturelle Nrf2. Des calculs d’intégrales (AUC) permettent d’établir un indice qui mesure l’effet antioxydant intracellulaire (indice AOP).
Mesure des EC50 et autres paramètres d’effet antioxydants
Les calculs d’indice LUCS à différentes concentrations en échantillon testé permettent à partir de courbes de tendances de type sigmoïde de calculer l’EC10 (Efficacy Concentration 10%) correspondant au seuil d’effet cellulaire du composé, l’EC50 (Efficacy Concentration 50%, standard de comparaison avec d’autres composés) et l’EC90 (Efficacy Concentration 90%) correspondant à la plus faible concentration à partir de laquelle le composé exerce un effet maximal sur le système cellulaire. La figure 3 illustre le cas du resvératrol après 1 h et 4 h de traitement sur cellules HepG2 humaines.
LUCS : un test à multiples facettes
D’une manière plus générale, le profil de fluorescence obtenu informe sur plusieurs paramètres propres à l’échantillon testé et au modèle cellulaire choisi. Outre l’effet antioxydant décrit plus haut, le test permet de mesurer des effets pro-oxydants (le profil échantillon est alors décalé vers la gauche par rapport au profil contrôle) ainsi que des effets cytotoxiques (la fluorescence basale est élevée et l’illumination reste sans effet. Ces différents profils sont indiqués sur la figure 4. La technologie LUCS est disponible sur tous types de modèles cellulaires eucaryotes (animaux, végétaux, champignons) comme procaryotes (bactéries).
